Głównym przeciwnikiem będzie teraz doktor Sophia Lamb, polityczna przeciwniczka Andrew Ryana i projektu Rapture, której przyświeca idea kolektywizmu i altruizmu. Do władzy doszła dzięki usunięciu Ryana i stworzyła w Rapture coś na kształt religii, którą wyznają teraz Splicerzy. Centralną postacią tego kultu jest pierwsza Little Sister - dokładnie ta, która została oddana pod opiekę pierwszemu Big Daddy i do której odnalezienia będzie dążył bohater. Mamy więc pierwszy punkt zapalny, ale z pewnością nie jedyny.
Inną postacią, która pojawi się w grze jest Augustus Sinclair. Biznesmen z półświatka, właściciel Sinclair Solutions - laboratorium testującego nowe plazmidy, które jest osią multiplayera. Nie zabraknie go jednak również w zwykłej grze. Tym razem to właśnie Sinclair będzie pomagał głównemu bohaterowi.
Multiplayer ma stawiać na dostosowanie postaci do swojego stylu gry za pomocą plazmidów i toników. Liczba dostępnych postaci ma sprawić, że każdy znajdzie coś dla siebie, a dodatkowo będzie można również zmieniać ich wygląd. Nie zabraknie oczywiście Tatuśka, w którego możemy się wcielić po znalezieniu stroju.
Okazuje się, że Big Sister to nie jeden dziwoląg, a cała ich armia, która ma stać na straży ekosystemu Rapture i ścigać złodziei substancji ADAM. To nie jedyna nowinka - do grona przeciwników dołączył również Brute, który ma być zdolny do stawienia czoła nawet prototypowemu Tatuśkowi, w którego wcieli się gracz. Walka ma być ciekawsza z uwagi na rozbudowanie defensywnego arsenału naszego bohatera. Wynika to z rozgrywki, w której napotkamy teraz małe oblężenia miejsc, w których Little Sister będą zbierały ADAM.
